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环磷酰胺对小鼠精子发生的影响
陈安 孙鸿喜 熊艾君
摘要:观察雄性小鼠经腹腔注射环磷酰胺(CY)后,在不同时期其精子及睾丸组织学的变化。结果:第34、36 d,精子计数下降(P<0.01)、畸形率增高(P<0.01);第21、28、34、36 d,生精细胞数均减少(P<0.05或P<0.01);睾丸超微结构(第36 d)的变化主要表现为各级生精细胞核膜的溶解、核的破坏及精子细胞顶体囊泡的异常,但紧密连接不受影响。提示CY通过对精原细胞及细线前期初级精母细胞产生毒害作用而影响精子发生。
关键词:环磷酰胺;精子;生精上皮
中图分类号:R73-361 R318.16 文献标识码:A
文章编号:1000-5633(2000)01-0002-02
环磷酰胺(cyclophosplamide,简称CY),是一种氮芥类抗肿瘤药物,据报道,CY治疗可引起男性病人的精子减少症和无精子症[1,2],毒理学实验常用CY作为精子畸形实验的阳性对照药物[3],其机制一般认为,CY是一种细胞毒素类药物,其氮芥作用于DNA、RNA、蛋白质,从而导致生精障碍。但有关CY抗精子发生的不同时期的效应及对睾丸形态学影响等的实验研究尚未见报道。本实验观察了CY在不同时期对小鼠精子形态和数量的影响及睾丸的显微和超微结构的变化,现报告如下。
1 实验材料
6~8周昆明种成年雄性小鼠64只,体重23~28 g,由实验动物中心提供。环磷酰胺,上海华联制药公司生产,批号:941119。日立H-600型透射电子显微镜。
2 方法
2.1 动物处理
按完全随机设计分对照组和实验组,每组小鼠各32只。实验组经腹腔注射30 mg/kg的CY,对照组注入生理盐水,每天1次,连续5 d,按体重等容积给药。在第1次注射后的第21、28、34、36 d,以颈椎脱臼法处死小鼠,每次每组8只,进行下述处理。
2.2 精子检查
取一侧附睾,放入盛有4 ml生理盐水的小平皿中,剪碎制成精子悬液。按张学书的方法[4]进行精子计数;按黄幸纾的方法[5]进行精子形态检查并计算畸形率。
2.3 睾丸切片检查
取一侧睾丸,固定于Bouin氏液,石蜡包埋,切片厚度5 μm,HE染色,高倍镜(×400)下统计20个圆形曲细精管断面上生精细胞数及支持细胞数,并求平均值。
2.4 睾丸的电镜检查
取另一侧睾丸(36 d),快速切取3~4个组织块,采用硝酸镧标记法[6]固定,环氧树脂包埋,半薄切片光镜定位,常规超薄切片,醋酸双氧铀及柠檬铅双重染色,日立H-600型透射电镜观察。
2.5 统计学处理
两样本比较采用t检验。
3 结果
3.1 CY对小鼠精子数量和形态的影响
实验组第34 d、36 d,精子计数明显减少(P<0.01),畸形率明显增高(P<0.01),表明CY能干扰小鼠精子的发生,但都发生在给药4周以后,说明与给药后的时间有关,见表1、表2。
表1 不同处理时间小鼠精子计数(万个/ml,n=8,±s)
组 别 21 d 28 d 34 d 36 d
对照组 542.1±87.5 540.0±85.7 541.2±90.3 538.7±89.6
实验组 534.5±90.7 538.6±92.4 385.0±74.8※ 372.6±75.8※
注:与对照组比较※P<0.01
表2 不同处理时间小鼠精子畸形率(%,n=8,±s)
组别 21 d 28 d 34 d 36 d
对照组 1.62±0.18 1.57±0.19 1.60±0.21 1.52±0.17
实验组 1.73±0.15 1.80±0.24 7.85±0.78※ 7.92±0.86※
注:与对照组比较※P<0.01
3.2 CY对小鼠睾丸生精上皮细胞数量的影响
实验组不同处理天数,曲细精管上皮的生精细胞数均低于对照组(P<0.05或0.01),并随实验天数的增加而递减,但支持细胞的计数无明显变化,见表3。
表3 不同处理时间小鼠曲细精管横切面生精细胞数、支持细胞数 (个,n=8,±s)
组 别 21 d 28 d 34 d 36 d
生精细胞 对照组 228.5±19.2 226.0±18.7 224.2±17.8 231.5±20.4
实验组 203.4±16.5△ 182.3±17.4△△ 168.7±16.0△△ 166.4±15.7△△
支持细胞 对照组 7.82±0.13 7.79±0.12 7.84±0.10 7.80±0.15
实验组 7.54±0.16 7.98±0.14 8.03±0.14 8.02±0.17
注:与对照组比较,△P<0.05,△△P<0.01
3.3 CY对小鼠睾丸超微结构的影响
在周期的第36 d时,睾丸的超微结构观察结果如下:
对照组可见精原细胞有序排列在基膜上,核膜清晰完整,核内染色质排列致密。初级精母细胞体大,核亦大,核膜清晰,核内异染色质呈丝状,胞质内线粒体发达。精子细胞顶体囊泡内含形态正常的顶体颗粒。变态期精子形态正常。支持细胞可见大量细胞器、脂滴,紧密连接处有硝酸镧标记物,显示结构正常。
实验组可见精原细胞核膜溶解,核内电子密度较低,细胞之间的间隙增宽,镧标记物渗入精原细胞间隙显示粗而明显,但标记物不通过紧密连接,提示血睾屏障结构正常。初级精母细胞发生核膜断裂、核破碎现象。精子细胞顶体囊泡异常扩大,顶体颗粒异常或消失,核膜溶解,核内物质外溢。变态期精子头部出现畸形。支持细胞内质网扩大,有大空泡出现,溶酶体和脂滴的数量增多,细胞核无明显变化,紧密连接完好,见附图。
附图 小鼠睾丸超微结构电镜图
1 对照组×5 000,示基膜,精原细胞,支持细胞及紧密连接(↑) 2 实验组×5 000,示精原细胞核膜溶解,镧标记物位于精原细胞的间隙内,标记物不通过紧密连结(↑) 3 对照组×5 000,示初级精母细胞,精子细胞及顶体颗粒(↑) 4 实验组×12 000,示精子细胞核膜断裂,顶体囊泡扩大、泡内未见顶体颗粒(↑)
4 讨论
小鼠精子发生过程按照生精细胞发育的顺序大致可分为3个时期,即精原细胞增殖期、精母细胞减数分裂期和精子形成期。据Oakberg[7]测定的小鼠生殖细胞发生周期表,在给药后的第21、28、34、36 d取材,分别可表示精子发生周期所处的阶段即精子细胞、细线期后的初级精母细胞、细线前期初级精母细胞和精原细胞。精子检查结果表明CY对精子细胞、细线期后的精母细胞没有明显影响,而对细线前期初级精母细胞及精原细胞的影响明显。可见药物对雄性生殖细胞的影响随受试物作用于精子发生的不同时期而异。其机理可能有二:其一,精子发生过程中DNA的合成是在细线前期初级精母细胞和精原细胞中合成的,以后发育的细胞不再进行DNA的合成,另外细线前期初级精母细胞还积极参与精子发生过程中所需的大部分蛋白质和酶[8];其二与血睾屏障有关,血睾屏障将曲细精管上皮分为基底小室和管腔小室二部分, 精原细胞和细线前期初级精母细胞位于基底小室内, 而正在发育的精母细胞和精子细胞位于管腔小室中, 两个小室的微环境不同[8]。 CY活化物能直接进入基底小室对精原细胞和细线前期初级精母细胞产生毒害作用,但为紧密连接所阻挡,不能直接进入管腔小室。
因此,CY干扰小鼠精子发生是有时间效应的,CY可能通过直接对精原细胞和细线前期初级精母细胞产生毒害作用而干扰精子发生。
有关药物与抗生育的关系,祖国医学早有论述,《山海经》中就记载有“蓇蓉,食之使人无子”。迄今已发现300余种中草药有抗生育作用[9],中草药的物源广泛,大多无毒副作用,已在计划生育中显示出广阔前景。本实验旨在为中草药抗精子发生的研究提供基础理论的依据或参考。
基金项目:湖南省科委资助项目(92-24004)
作者简介:陈安(1966-)女,湖南茶陵人,湖南中医学院讲师,硕士,主要从事抗生育研究
作者单位:陈安(湖南中医学院 基础课部,湖南 长沙410007)
孙鸿喜(湖南中医学院 基础课部,湖南 长沙410007)
熊艾君(湖南中医学院 基础课部,湖南 长沙410007)
参考文献:
[1] 郭瑞林.实用男性疾病诊断治疗学[M].北京:人民军医出版社,1994.135.
[2] Whorton et al.J.Occupy Med[J].1979,21:161~166.
[3] 云淑梅,林慰慈,沈惠麒.氯乙烯对小鼠精子畸形的影响[J].北京医科大学学报,1995,27(4):273~277.
[4] 张学书,朱靳良,周袁芬,等.醋酸铅对小鼠精子发生影响的研究[J].上海医科大学学报,1993,20(1):5~10.
[5] 黄幸纾.环境化学的致突变、致畸、致癌实验方法[M].杭州:浙江科技出版社,1985.249~266.
[6] 张淑安,唐外星,刘大冲,等.镧盐块染技术在急性脑出血与再灌流模型中的应用[J].湖南医科大学学报,1989,14(1):24~26.
[7] Oakberg EF.Duration of spermatogenesis in mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium[J].Am J.Anat,1956,94:507.
[8] 成令忠.组织学[M].北京:人民卫生出版社,1993.1358.
[9] 张秀成.抗生育中草药[M].北京:北京科学技术出版社,1994.1.
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